相信很多開發(fā)HPLC方法的實(shí)驗(yàn)研發(fā)人員都開發(fā)出了無(wú)法分離混合物重要成分的方法，其方法可以是調(diào)整流動(dòng)相、固定相或柱溫,另一種有效的方法是改變色譜柱粒徑。粒徑較小的液相色譜柱產(chǎn)生較高的塔板數(shù)以獲得更尖銳的峰，并且能夠分離緊密洗脫的峰。一些高分子量化合物在小孔徑填料上可能無(wú)法分離，但在用大孔徑填料填充的色譜柱上很容易分離。

       通常解決緊密或共洗脫峰的有效的方法是改變流動(dòng)相組成或柱填料顆粒的鍵合相功能 。分辨率方程清楚地確定了影響峰分辨率的三個(gè)主要因素：其中Rs是兩個(gè)靠近洗脫峰的分辨率（間距）；k是代表保留的容量因子；α 是靠近洗脫峰的容量因子的比率；N為代表柱效的柱塔板數(shù)。反相 HPLC 是一種非常強(qiáng)大的方法，通常可以毫不費(fèi)力地實(shí)現(xiàn)分離，有時(shí)甚至只需要初始操作條件。然而，重疊和疊加的峰通常會(huì)產(chǎn)生，因此需要改變操作條件。有幾種方法可以提高重疊峰的分辨率或帶間距，或者解耦疊加的峰。

一、相對(duì)保留的調(diào)整：

      有時(shí)可以通過(guò)調(diào)整容量因子k（保留）值來(lái)對(duì)分離不嚴(yán)重重疊的峰進(jìn)行微小改進(jìn)降低流動(dòng)相的強(qiáng)度。

二、通過(guò)提高柱效提高分離度：

      適度重疊的峰通?？梢酝ㄟ^(guò)提高柱效來(lái)解決，通過(guò)增加柱塔板數(shù)來(lái)銳化峰（減少峰體積）。一種有效的方法是使用顆粒較小的色譜柱，因?yàn)檫@會(huì)增加塔板數(shù)并提高柱效。

三、通過(guò)改變流動(dòng)相有機(jī)改性劑增加譜帶間距：

      在反相 HPLC 中改善譜帶間距的有效方法是改變流動(dòng)相成分以增加 α 值。如果在初始分離中觀察到嚴(yán)重重疊或疊加的峰，則此方法更適合。改變有機(jī)改性劑是產(chǎn)生峰間距變化的有效途徑。例如，如果初始分離使用乙腈作為有機(jī)改性劑并顯示出此問題，建議的方法是更換改性劑：先換成甲醇或再換成四氫呋喃。

      根據(jù)實(shí)際情況，有時(shí)可以通過(guò)增加柱塔板數(shù)、使用更小的顆?；蛟黾又L(zhǎng)來(lái)改善分離。但這些方法的缺點(diǎn)是較高的操作壓力和較長(zhǎng)柱的分離時(shí)間增加。其中有效的方法是改變流動(dòng)相有機(jī)改性劑或色譜柱功能，在這種情況下分離時(shí)間不會(huì)增加，有時(shí)可以縮短以實(shí)現(xiàn)更快的分離。對(duì)于肽和蛋白質(zhì)等大分子，使用孔徑較大的色譜柱顆粒很重要。

      今天恒譜生分享的知識(shí)先到這啦，希望對(duì)您的工作有所幫助！